[VIP第1年] 指数:3
使用萤火虫荧光素酶（Fluc）作为报告基因和 D-荧光素作为底物的生物发光成像（BLI）是目前应用*****的技术。将总信号强度相对于 D-荧光素注射后的时间进行绘制，以生成时间-强度曲线。除了峰值信号外，还确定注射 D-荧光素后固定时间点（5、10、15 和 20 分钟）的信号作为峰值信号的替代。给定时间-强度曲线中的信号针对曲线中的峰值信号进行归一化，以表示 D-荧光素注射后时间变化的模式[3]。每克体重注射 10 μL D-荧光素（腹膜内或静脉注射）储备液：对于 20 g 小鼠，标准 150 mg/kg 注射通常约为 200 μL。在室温下解冻 D-荧光素（钾盐或钠盐）并溶解在 dPBS（不含钙或镁）中，**终浓度为 15 mg/mL。通过吸取 5-10 mL 无菌水来预湿 0.22 μm 过滤器。罗丹明具有出色的光稳定性以及许多光物理特性，使其非常适合用作激光染料、荧光探针和颜料。重庆荧光染料Fluor 647
一：染色液制备1、配制储液：储液用无水DMSO或无水EtOH配制，浓度1~5mM。注：未使用的储液建议分装后储存在-20℃，避免反复冻融。2、工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储液，配制浓度为1~5μM的工作液。注：工作液**终浓度建议根据不同细胞系和实验体系来优化。建议从推荐浓度的10倍范围内开始比较好浓度的摸索。二：悬浮细胞染色1、加入适当体积的染色工作液重悬细胞，使其密度为1×106/mL。2、37℃孵育细胞2~20min，不同的细胞比较好培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记效果。3、孵育结束，1000~1500rpm离心5min。倾倒上清液，再次缓慢加入37℃预热的生长培养液重悬细胞。4、重复步骤3两次以上。河北抗体荧光染料荧光素衍生物具有高吸收率优异的荧光量子产率和良好的水溶性是流式细胞仪和免疫荧光中常用的荧光标记之一。
二、***成像分析：D-荧光素，钾盐，D-PBS,不含钙、镁1、配制溶液使用无菌D-PBS（w/oCa2+;Mg2+）配制D-荧光素钾盐溶液（15mg/ml），0.22µm滤膜过滤除菌（避光），分装后于-20℃或-80℃冷冻保存，避免反复冻融。使用时4℃融化，实验前平衡至室温（避光）2、注射量取决于注射方式，具体如下：注射方式剂量静脉注射（25-27gauge针头）按10µl/g体重浓度，加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液腹腔注射（25-27gauge针头）按10µl/g体重浓度，加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液肌肉注射（27gauge针头）50µl，浓度为1-2mg/ml荧光素工作液鼻内注射（pipette）50µl，浓度为3mg/ml荧光素工作液3、注射入体内10-20min（待光信号达到**强稳定平台期），再进行成像分析
荧光染料***用于生物学和医学研究中，如流式细胞术、荧光显微镜和免疫组化等，其中荧光淬灭是一个关键的考量因素，因为它直接影响到实验结果的可靠性和准确性。FITC（异硫氰酸荧光素）是一种常用的绿色荧光染料，具有较高的荧光量子产率和激发效率。然而，FITC的一个主要缺点是容易受到环境因素的影响，如pH值、温度、溶剂和离子强度等，从而导致荧光淬灭。此外，FITC的光稳定性相对较低，长时间的光照会导致其荧光强度降低。CY5.5是一种远红外荧光染料，具有较长的激发和发射波长，因此适用于多色荧光标记和深组织成像。CY5.5相对于FITC来说，具有更好的光稳定性，不易受到环境因素的影响。此外，CY5.5的荧光量子产率也较高，使其在荧光标记实验中表现出色。AlexaFluor647是另一种常用的红色荧光染料，具有与CY5.5相似的长波长激发和发射特性。AlexaFluor647的优点是光稳定性较好，可以承受长时间的光照而不易淬灭。此外，它在多种溶剂和pH值范围内都能保持稳定的荧光性能，因此在复杂的生物样本中表现出色。
南京星叶生物科技有限公司Super Fluor系列（效果同Alexa Fluor 系列），质优价廉。 Cy7 DiC18（DiR）是一个亲脂性、近红外荧光花青染料，这个染料常用于标记细胞质膜。
纳米粒子纳米颗粒是指尺寸在1到100纳米之间的颗粒。由于它们的小尺寸，纳米粒子通常用于不同类型的细胞和组织的荧光成像。当今生物成像中常用的一些纳米材料包括碳点、贵金属纳米颗粒、聚合物点、量子点和荧光掺杂二氧化硅等。在成像中，与其他分子荧光团和探针相比，纳米颗粒/纳米材料具有多种优势，使其成为理想的选择。除了提高亮度外，纳米粒子是惰性的并且往往分布均匀，这有助于在成像过程中获得更好的结果。此外，与各种分子荧光团相比，纳米颗粒和纳米材料没有细胞毒性，并且不受非特异性结合问题的影响。由于这些特性，大多数荧光纳米颗粒（染色纳米颗粒）可以内化到细胞/组织中，并容易靶向给定部位。Cy5.5含有一个游离胺基,可与多种官能团共轭,包括NHS酯和环氧化合物。江苏成都荧光染料
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三：贴壁细胞染色1、将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。2、从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，但要使表面保持湿润。3、在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。4、37℃孵育细胞2~20min，不同的细胞比较好培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记效果。5、吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2~3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5~10min，然后吸干培养基。但要使表面保持湿润。四：结果检测样品可在培养基中进行检测，可通过荧光显微镜成像或流式细胞仪分析。重庆荧光染料Fluor 647
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