[VIP第1年] 指数:3
使用包含 3 种不同浓度的 ROX 染料的预混液对 TGF-β 进行扩增。显示 (A) Ct 值和 (B) 标准差随 ROX 染料浓度的变化。降低 ROX 染料浓度导致 Ct 出现得更早，但是会增大标准差。使用 Applied Biosystems 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增，上海DNA甲基化荧光定量PCR课题承包。
Ct 随 PCR 效率发生变化。蓝色标准曲线的效率为 **（斜率为 –3.3）。绿色标准曲线的效率为 78%（斜率为 –4）。与高效率条件相比（蓝色），在低效率条件下（绿色），扩增量 Y 使 Ct 出现得更早，上海DNA甲基化荧光定量PCR课题承包。较低扩增量 (X) 时则情况相反，上海DNA甲基化荧光定量PCR课题承包，与高效率条件（蓝色）相比，低效率条件（绿色）使 Ct 出现得更晚。
荧光信号**扩增阶段：只有在荧光产生进入**期， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在PCR反应处于**期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板**初的含量而进行定量分析。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。通过已知起始拷贝数的标准品可得到标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
在平台期，扩增产物已不再呈**级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA拷贝数
为了正确地评估 PCR 效率，至少需要 3 次重复和至少 5 个数量级倍数的模板浓度。图 6 说了建议此精确级别的理由，它证明在 1 个数量级倍数与 5 个数量级倍数范围内测试稀释模板时，获得的斜率或效率可能产生数学偏差。因此，即使检测 ** 有效，由于每个稀释点都存在标准差，检测一个数量级倍数的连续稀释时，可能获得 70 至 170% 的范围。在 5 个数量级倍数范围内做相同数量的稀释点或重复，可能的偏移只有 ±8%。这意味着在 5 个数量级倍数范围内，如果效率为 94%，则该实验的效率范围介于 88% 到 ** 之间。为了准确测定 PCR 反应的效率，必须进行 5 个数量级倍数的连续稀释。-3.3 ±10% 的斜率意味着效率达到 ** ±±10%。PCR 反应效率越低，那么灵敏度越低。
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