荧光定量PCR实验步骤:
取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟,福建MiRNA 荧光定量PCR实验技术服务。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中,福建MiRNA 荧光定量PCR实验技术服务。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,福建MiRNA 荧光定量PCR实验技术服务,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
荧光染料可与双链DNA结合,每个循环的延伸阶段,染料掺入双链DNA中,其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时,其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时,该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合,发出荧光,从而干扰对特异性产物的准确定量。
常用的染料为SYBR Green I,各公司针对荧光信号强度、***作用等进行改进,也推出了很多新的染料供大家选择。
Promega采用新型荧光染料BRYT Green® Dye,对qPCR反应没有***作用,与双链DNA结合后荧光信号更强.
在使用具有相同 ROX 水平的两种预混液的一次检测中获得的原始荧光数据。信号差异是由预混液的成分造成的。使用 Applied Biosystems™ VIC™/MGB 探针在 Applied Biosystems™ 7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统上执行此反应。x 轴显示荧光基团的的发射波长,y 轴显示发射强度。
任何分子的荧光发射都受环境因素的影响,比如溶液的 pH 值和盐浓度。图 2 显示某个 Applied Biosystems™ TaqMan® 探针在两种不同预混液背景下的原始荧光数据。请注意,尽管两组反应的靶标、探针和 ROX 染料浓度都相同,预混液 A 中的荧光强度更高
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