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云南荧光定量PCR检测服务 欢迎咨询 上海朝瑞生物科技供应

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***更新: 2020-01-21 07:19:07
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产品详细说明

有关转基因及其产品的安全性的争论在国内外愈演愈烈,各国**纷纷出台一系列的政策、法规,要求对转基因作物进行标识,有些国家对转基因的比较低含量做了限定,其阈值大小从1-5%不等。这就要求必须对转基因及其产品进行检测。 常规的检测方法多采用PCR法,如PCR-凝胶电泳、PCR-ELISA等。这些方法普遍存在着PCR产物污染、特异性不高及速度慢等问题。荧光PCR技术是一种新近发展起来的检测技术,它的应用将从根本上解决这些问题。 1.收集了国内外商品化的转基因作物品种,并通过查阅有关文献及网站初步确定了各种作物的转基因构建图; 2.于反应体系中引入UNG去污染酶,建立了无污染荧光PCR扩增体系; 3.以植物内源基因18SrRNA为靶标,设计了特异性引物和荧光探针,建立了以18SrRNA基因的扩增与否来判断核酸提取质量好坏的方法; 4.以FAM荧光素为标记,建立了以35S、NOS,云南荧光定量PCR检测服务、NPTⅡ、Pat,云南荧光定量PCR检测服务,云南荧光定量PCR检测服务、Bar、FMV和CryⅢa为筛选目标的转基因农作物荧光PCR定性检测体系; 5.分别以FAM和TET两种荧光素标记外源基因和内源基因,建立了转基因大豆及转基因玉米的荧光定量PCR检测体系。

比较Ct值的相对定量法:此方法是将待测靶基因片段和内参照基因片段同时扩增,可以在两个反应管中或者一个反应管中进行扩增反应,并且就两者的ct值之差进行测量。在采用此方法过程中需要用数学公式进行相对量的计算,首先要假设每个循环产物增加一倍时PCR反应**期得到Ct值对起始模板的量一个循环的估算和起始模板数两倍相当。这种方法的前提是靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致,所以在应用过程中效率的偏移会对实际拷贝数估计产生一定影响,因此,为了保证目的基因和内参基因的扩增效率相等应当加强对反应体系的优化,这也是该方法应用的难点之一

实时荧光定量常用Taqman探针法和SYBR Green I法两类。

1.TaqMan探针法

TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理为有一对 PCR 引物和一条探针存在于PCR 反应体系中,有荧光淬灭基团存在于3′

端标记,有报告基团存在于探针的5′ 端标记,探针*和模板特异结合,两条引物之间是其结合点。因此信号仪器搜集不到,伴随反应的进展,探针在外切核酸酶的活性的作用下被切断,从而造成淬灭基团不能吸收基团的荧光能量,从而使荧光信号产生,所以模板 DNA 的拷贝数取决于信号的强度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I为一种具有绿色激发波长的染料,其发射波长比较大约为 520 nm,比较大吸收波长约为 497 nm,能够结合所有的双螺旋小沟区域。由于处于游离状态,SYBR Green I发出的荧光较弱,然而其结合双链 DNA之后,就会使得荧光**增强,荧光信号的增加完全同步PCR 产物的增加。

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